噬菌体在水生动物病害防治中的应用问题和解决策略

水产品为人类提供了 17%的动物蛋白摄入，其 中约50%来自水产养殖业。2014年世界水产品养 殖产量为7.380 X 10⁷ t,水产养殖业对人类水产品 消费的贡献首次超过野生水产品捕捞。我国是 世界第一水产养殖大国,018年全国水产养殖量为 4.991 X 10⁷ t,水产养殖量占世界总量的60%以 上。然而，集约化养殖模式不可避免带来养殖环 境污染和水产动物病害频发的问题。全国每年因 病害造成的水产养殖经济损失约为150亿元，并以 细菌性疾病为主，约占全部病害经济损失的50% 以上 。长期以来，水产养殖动物细菌性病害的防治主 要依赖于抗生素(包括人工合成抗菌药物)。据统 计,1996—2013年我国水产养殖中曾报道使用的抗 生素有8大类，共计20个品种，目前有11个品种被 批准允许应用于水产养殖。但抗生素的大量使 用，带来了水产品药物残留、细菌耐药性和环境污 染等突出问题。研发新型抗生素替代品乃迫切之 需，一些具有潜在应用前景的抗生素替代品相继被 开发应用，如寡聚糖、益生菌、天然植物提取物及噬 菌体等。噬菌体是一类细菌性病毒，其中烈性噬菌体在 感染宿主菌后能在较短时间内完成复制周期，并裂 解宿主菌释放子代病毒颗粒，从而达到抗菌效果。 噬菌体是一种极具潜力的抗生素替代品，且已在陆 生动物和水生动物病害防治中显示出良好的应用 前景。与传统的抗生素相比，噬菌体具有专一性 强、可自我复制增殖、来源丰富、筛选方便等突出优 势。笔者综述了目前国内外噬菌体在鱼、虾、贝类 等水产动物病害防治中的最新研究概况、存在的问 题及解决策略，旨在为我国水产养殖业发展绿色生 态防控技术提供新思路。

1、噬菌体在水产养殖动物病害防治中的应 用研究早在20世纪80年代，Wu等首先提出用噬 菌体防治嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila ), 并证实了噬菌体的体外杀菌效果，但并未通过动物 体内试验验证。Nakai等首次研究了噬菌体对黄 条鲫(.Seriola aureovittata )幼鱼格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)感染的治疗效果。试验先对黄条鲫 腹腔注射格氏乳球菌攻毒，随后立即腹腔注射13 X 1 0⁷pfu的噬菌体PLgY-1 6,10 d后病鱼的存活率 由10%升至100%,可见噬菌体具有显著治疗效果。 随后,噬菌体被陆续尝试用于防治香鱼(Plecoglossus al.tivel.is)冷水病、大西洋鮭(Salmo salar )杀鮭气 单胞菌(A. salmonicida )感染、斑节对虾(Penaeus monodon)发光病,以及皱纹盘鲍(Haliotis discushannai)^11 和仿刺参(Apostichopus japonicus )弧菌 病等，相关代表性研究见表1。迄今，大多数研究是以人工攻毒感染的动物为 模型，再将噬菌体以口服、浸浴、腹腔或肌肉注射等 方式给药，后根据动物的发病率或存活率来判断噬 菌体的防治效果。如在鱼类养殖中，Park等对 香鱼口服变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossi.- cda)攻毒后，立即饲喂PPpW3、PPpW/两种噬菌 体的混合物，两周后香鱼死亡率从65.0%降至 22.5%; Higuera 等［1/］用 5 X 10⁵ cfu/mL 鳗弧菌 (Vibrio anguilarum ) Va PF4对大西洋鮭进行浸 浴攻毒，同时按感染复数为1和20的剂量加入噬菌 体CHOED,鱼的存活率由7%升至100%。在对虾 养殖中,Karunasagar等[0]针对哈维氏弧菌(V. harry)引起的对虾发光弧菌病，在攻毒后每隔1 d 用2 X 1 0⁶ pfu/mL噬菌体Vihal 0和Viha8浸浴，斑 节对虾幼体存活率与抗生素治疗组相比由65%升 至88%o在贝类养殖中，李太武等[11]对皱纹盘鲍 足部肌肉注射河流弧菌(V. fauvais)进行攻毒， 同时以感染复数为10的剂量注射噬菌体，7 d后与 对照组相比，皱纹盘鲍的死亡率由70%降至20% 。

总体可见，噬菌体能显著提高攻毒感染动物的存活 率，具有较显著的防治效果。但也有个别研究显示噬菌体对鱼类病害无防 治效果。Verner Jeffreys等[9]以被杀鮭气单胞菌攻 毒感染的大西洋鮭为模型，将3株噬菌体O、R、B 混合制成“鸡尾酒”制剂，再对鱼进行饲喂、浸浴和 腹腔注射噬菌体，均未能降低大西洋鮭的死亡率。 可见，影响噬菌体体内作用效果的因素较为复杂, 对噬菌体治疗失败的原因尚有待深入研究。噬菌体疗法尚存在的问题及解决策略2.1噬菌体的裂解宿主谱窄噬菌体裂解细菌的作用，具有严格的宿主特异 性，一般仅限于细菌分类学上“种”的界限之内，大 多噬菌体仅对某种细菌里的某些特定株有裂解作 用，这种专一性要求噬菌体在水产养殖中应用时需 预先建有能涵盖各种病原菌的噬菌体库，且能够快 速诊断出病原及其噬菌体易感性。目前解决噬菌体裂解谱窄的常见方法是“鸡尾 酒”法，即将针对同种宿主菌的几株不同噬菌体混 合后联合应用，如用于控制肉制品中李斯特菌(Ls ter a ) 的 L.ixtex™ Pl 00为6株单增李斯特菌(L. monocytogenes)噬菌体的混合物。在水产养殖 中，仿刺参“化皮病”的病原也具有多样性的特点, 如灿烂弧菌(V. splenddus)溶藻弧菌及杀鮭气单 胞菌等均曾被证实能引起仿刺参化皮，但目前噬菌 体用于仿刺参化皮的研究仅针对弧菌，尚未见将不 同宿主的噬菌体混合后使用。值得注意的是，自然界分离到的少数噬菌体株 具有宽谱特性，这在肠杆菌和葡萄球菌噬菌体中较 为常见。一些弧菌噬菌体也显示出宽谱特性，如噬 菌体KVP40能同时裂解8种弧菌，其中包括副溶 血弧菌、溶藻弧菌和灿烂弧菌等，甚至能跨出“属” 的界限裂解鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathid)5 ；与此类似，鳗弧菌噬菌体CHOED也能 裂解病海鱼弧菌(V. odali )

4。可见，筛选宽谱 噬菌体也是解决噬菌体宿主谱的一种可行方案。此外，噬菌体的特异性基于其尾丝蛋白与宿主 菌表面受体的专一性结合，对噬菌体进行基因工程 改造，特别是其尾丝蛋白部分，也能有效拓宽其宿 主谱。如T2噬菌体仅能裂解7%的大肠杆菌分离 株，利用同源重组的方法将T2尾丝蛋白基因gp37 和gp38与另一株宽谱噬菌体IP008替换，这种改造 后的T2噬菌体宿主谱明显变宽，能裂解33%的大 肠杆菌分离株。

2.病原菌易对噬菌体产生抗性细菌易对噬菌体产生抗性，这可能是限制噬菌 体作用效果的关键因素。噬菌体完成一个复制周 期需经吸附、核酸注入、核酸复制、基因转录与蛋白 质生物合成、装配及释放几个步骤，宿主菌阻碍其 中任一步骤即可产生抗性，如阻碍噬菌体吸附、抑制噬菌体核酸注入、切割噬菌体核酸及流产感染系 统等。在体外培养物中，噬菌体抗性菌株在数小时或 数日内即可出现。将多株噬菌体混合后的“鸡尾 酒”法虽能有效延缓噬菌体抗性菌株的产生，但仍 难以完全消除培养物中的宿主菌。与持留菌对抗 生素耐药类似，笔者推断细菌群体中存在一小部 分生长缓慢、代谢活动弱的亚群，虽未发生基因抗 性突变，但对噬菌体不敏感。这些持留菌接种到新 的培养基中可再次生长起来，又呈现出大部分细菌 能够被噬 菌体杀死, 仅 有 一 小 部 分 存 活 下 来 的 情况。不过在水产动物体内环境下，病原菌会遇到复 杂多样的选择性压力，如营养缺乏、其他微生物竞 争及宿主免疫防御等，噬菌体抗性菌株并不易出 现。Nakai等从经噬菌体处理的黄条鲫体内分离 的所有格氏乳球菌对噬菌体PLgY-16依然敏感；与 此类似，Park等从经噬菌体处理后但仍然病死 的香鱼体内也未分离出噬菌体抗性突变菌株。这 也提示体内细菌在没有发生抗性突变的情况下也 能逃避噬菌体的裂解，单一应用噬菌体难以完全清 除体内病原菌。值得注意的是，某些细菌的毒力因子也是噬菌 体的吸附受体，如脂多糖、外膜蛋白或荚膜等。致 病菌株可以通过受体突变缺失或结构变化对噬菌 体产生抗性，这时会伴随着毒力下降，或对抗生素 更加敏感，表现出进化生物学中的权衡现象。如变 形假单胞菌野生分离株对香鱼的半致死剂量为 1012 cfu/尾，而噬菌体抗性突变株对香鱼的半致死 剂量> 1 0⁴ cfu/尾，毒力显著降低，但具体原因并未 阐明。Chan等研究发现，噬菌体OMKO1以 铜绿假单胞菌外排泵Mex AB-OprM上的外膜通 道蛋白OprM为吸附受体，在噬菌体的选择压力 下，铜绿假单胞菌OprM基因突变，外排泵功能丧 失，导致对几种抗生素类药物的敏感性增加，这为 噬菌体与抗生素组合使用提供了理论依据。2.噬菌体的给药途径水产养殖中噬菌体的给药途径有腹腔或肌肉 注射、通过饲料口服以及浸浴，针对一些体表外伤, 也有涂抹法。但注射、涂抹给药方式可操作性 差，可行的给药途径是通过饲料口服或浸浴。口服噬菌体首先需要解决胃酸屏障问题。除 少数噬菌体(如X噬菌体)对酸有较强耐酸性外，大 部分噬菌体对酸敏感，一般在pH <3.0时迅速失 活。与陆生动物相比，鱼的胃液pH相对较高，特别 是一些幼鱼，如黄条鲫幼鱼胃液pH在5.2〜6.0间 变化，口服噬菌体能够稳定穿过胃酸屏障。但对 一些胃液酸性较强的鱼类而言［如虹鱒Oncorhyn- chus my kiss),静息状态下胃液pH为23 , 口服 噬菌体易遭胃液破坏而丧失抗菌活性。在陆生动 物中，目前解决胃酸屏障的方法有2种：(1)使用抗 酸剂中和胃酸，如CaO .Mg (OH) 2等，或用雷尼 替丁和奥美拉唑等药物来抑制胃酸分泌；2)对 噬菌体进行微囊化包埋，Ma等曾用静电振动 喷嘴一离子络合凝胶法分别制备出海藻酸钙/壳聚 糖微球、海藻酸钙/乳清蛋白微球以及掺杂CaCCh 无机微粒的海藻酸钙微球，成功用于噬菌体Felix O1和噬菌体K的包埋，有效解决了 口服噬菌体在 动物胃肠环境中的稳定性问题。这几种微球在水 产养殖动物中的应用是笔者所在团队目前正在进 行的工作。口服噬菌体一般主要针对动物胃肠道感染，但 噬菌体不能黏附或定殖于动物肠道中，故很快会被 排出体外。不过，也有部分噬菌体可穿过动物肠黏 膜进入循环系统，如口服变形假单胞菌噬菌体 PPpW-3和PPpW-4能进入香鱼循环系统，并转运 到达肠、肾、脾等组织器官，消减感染组织中的病原 菌。口服噬菌体从动 物肠道进入循环系统的机制目前尚未完全阐明，可 能是通过类似细菌肠道移位的过程实现，且决定噬 菌体能否移位的因素包括多个方面，如噬菌体衣壳 蛋白的序列，与肠道免疫细胞的相互作用等。然而口服给药对处育苗阶段或感染后不摄食 的水产养殖动物难以适用，浸浴法是另一种较为理 想的给药方式。水体中噬菌体易与目标宿主菌株 碰撞吸附，这对控制通过皮肤和鳃组织侵染的水产 致病菌更具优势。不过，目前这种方法仅限于实验 室环境下封闭水体中的应用，是否适应于大规模开 放水域还有待进一步研究。

2.噬菌体的给药剂量噬菌体能够自我复制增殖，若噬菌体在一个裂 解周期内产生200个子代病毒颗粒，那么理论上它 将以200"方式进行指数增殖,这意味着单次给药 即可实现理想治疗效果；而抗生素类小分子药物由 于体内的代谢消除作用, —般需重复多次给药 方可达到药效。Smith 等曾以经大肠杆菌 (O18ac：H7：K1)攻毒感染的小鼠为模型，证实了单 剂量噬菌体治疗效果显著优于多剂量的抗生素，其 中包括氨苄青霉素、四环素、氯霉素和磺胺异恶唑。但很多研究发现，噬菌体感染复数越大，对动 物保护效果愈佳，在低剂量时常无防治效果。 Zhang等将PVA1和PVA2两株噬菌体混合后， 对仿刺参进行腹腔注射，在感染复数分别为10、1、 0.时，可将攻毒感染仿刺参的存活率由3%分别提 升至73% ,0%和47%。Madsen等向虹鱒幼苗 腹腔注射1(0 cfu/尾嗜冷黄杆菌(F lavobacterium psychrophilum),再腹腔注射1(0 pfu/尾噬菌体 FpV9 ,未能提高鱼的存活率。这些研究均表明，噬 菌体在低剂量给药时无治疗效果，可能的解释是体 内环境下的大多数宿主细菌处于生长缓慢或停滞 的生理状态，噬菌体对其吸附感染能力下降，仅能 通过初级感染方式完成杀菌作用。可见，噬菌体合 理给药剂量目前仍难以确定，而这有待于未来噬菌 体在不同水产动物体内药代动力学特征的阐明。

2.5噬菌体的给药时间噬菌体的治疗效果与其给药时间密切相关，一 般动物感染后噬菌体制剂应用越早，存活率越高。 在动 物 感 染 后 期, 噬 菌 体 的 治 疗 效 果 很 有 限。 Nakai等对黄条鲫腹腔注射格氏乳球菌攻毒，并 于攻毒后0、1、24 h分别腹腔注射13X107 pfu/尾 剂量的噬菌体PLgY-16进行治疗，10 d内感染鱼的 存活率分别为100%、80%和50%。与此类似，卤虫 (Artemia franciscana )无节幼体被副溶血性弧菌感 染后立即加入噬菌体Vpmsl，其存活率为88%;但 攻毒后延迟5 h加入噬菌体，卤虫存活率则仅为 5.8%。近年Roach等提出了“免疫噬菌体协 同作用”的概念，并证实噬菌体治疗小鼠铜绿假单 胞菌感染需要其非特异免疫系统的协助。据此，笔 者推测动物自身的免疫系统可能对噬菌体防治效 果发挥关键作用，在感染后期，动物免疫功能低下 或受损，噬菌体治疗难以奏效。此外，噬菌体病毒颗粒难以进入动物细胞内, 而在感染后期，某些病原菌能侵入胞内逃避噬菌体 的裂解,如迟钝爱德华氏菌(Edwardsiela tarda ). 沙门氏菌(Salmonella )、结核分枝杆菌(Myobacterium tuberculosis) 等。目前一种可行的解决策略是 以减毒宿主菌作为载体将噬菌体导入胞内，如以减 毒耻垢分支杆菌(M. smegmatis)为载体，携带噬菌 体TM4进入巨噬细胞，可显著降低小鼠脾脏巨噬 细胞内的分支杆菌数量,但这种方法还有待于在 其他噬菌体及宿主系统中验证。

2.6噬菌体在水产动物中的药代动力学特征尚未 阐明噬菌体是一种依赖宿主菌、能自我复制的病毒 颗粒，它在鱼体内的吸收分布规律及代谢动力学特 征目前尚未完全阐明。与抗生素小分子药物相比, 噬菌体在动物体内抗菌作用过程中具有两个显著 特点：一是噬菌体能够在体内自我复制增殖；

二是 噬菌体作为异源物质具有免疫原性，可能会刺激鱼 机体产生免疫反应，产生的抗体可能会对噬菌体产 生消除作用。这两个特征致使噬菌体的体内吸收 分布规律及代谢动力学特征难以被准确描述。 Payne等建立了预测噬菌体体内群体动力学的 数学模型，指出噬菌体初始给药剂量、治疗时间及 宿主菌密度是决定治疗成败的关键，但此模型是基 于噬菌体的体外生长数据，是否适用于动物体内尚 有待进一步验证。与高等脊椎动物相似，鱼类免疫组织包括分布 于胸腺、脾脏等器官中的系统淋巴组织和存在于 肠、鳃等器官中的黏膜淋巴组织。对哺乳动物的 研究发现，腹腔注射噬菌体会刺激机体产生抗体, 且影响噬菌体的体内裂菌效果。最近研究发现, 口服噬菌体能刺激小鼠肠黏膜免疫应答产生分泌 型抗体IgA,显著降低了噬菌体活性。此外，机 体网状内皮系统也能将噬菌体从循环系统中清 除。 但鱼机体的 免疫反 应对体内 噬菌体的吸收 分布及消除过程的影响还是个未知问题。有研究 发现，香鱼口服或肌内注射变形假单胞菌噬菌体 PPpW-3、PPpW-4后，血清中均未检出能中和噬菌 体的抗体，其原因可能是这些噬菌体分离株对香鱼 的免疫原性低，或是给药剂量过低。同种宿主不同噬菌体间的免疫原性相差很大, 如大肠杆菌T4噬菌体免疫原性大于T1和T5, 这提示，可以针对某特定宿主菌筛选出免疫原性较 低的噬菌体。Merril等就曾采用体内连续传代 的方法，筛选出能在循环系统长期存活的噬菌体突 变株，这为解决噬菌体免疫原性问题提供了思路。 此外，目前蛋白类药物可通过聚乙二醇修饰的方法 降低免疫原性，从而延长药物在体内的半衰期；与 此类似,Kim等用单甲氧基聚乙二醇修饰噬菌体 后，也能有效延长噬菌体在血液中的循环时间并阻 止其被免疫系统快速清除。值得提出的是，对一些缺乏特异性免疫系统的 低等水产养殖动物, 如仿刺 参, 噬菌体应用 时受宿 主免疫系统影响较小等研究发现，噬菌体 能通过浸浴途径进入仿刺参体腔液并较长时间滞 留，且活性不受超氧化物歧化酶和溶菌酶等非特异 性免疫因子的影响。

2.噬菌体应用的安全性问题噬菌体在自然界中无处不在，凡有原核生物活 动的地方几乎都发现有相应的噬菌体存在，据估计 地球生物圈中噬菌体数目高达1 0 ³⁰〜1 0³²个,尤 其以海洋中的噬菌体数目和种类最多，如在表层海 水中噬菌体的丰度达到近10⁷个/mL,是细菌丰度 的5~25倍。此外，人和动物体内就寄居着各种 噬菌体，如人的胃肠道、尿道、皮肤以及口腔中均有 噬菌体存在。因此，噬菌体是人或动物体内的 正常共栖生物体，安全性毋庸置疑。目前已有多个 噬菌体产品被美国食品药品监督管理局认定为公 认安全级产品，如荷兰Micreos Food Safety公司的 Llstex™ PI 00,美国 Int.ralyt.ix 公司的 SalmoFresh™等。但是，部分温和噬菌体携带一些编码毒力因子 的结构基因，可整合到宿主菌的基因组上，赋予其 产毒能力，如霍乱弧菌(V. cholerae')和拟态弧菌(V. mimicus)的主要毒力因子霍乱毒素就是由丝状噬 菌体CTX①携带的ctxAB基因所编码;且溶源 性霍乱弧菌中的前噬菌体CTX①在受到外界理化 因素诱导后，可脱离宿主产生成熟的噬菌体颗粒 CTX®,它又会侵染新的无毒菌株，这样就造成了 ctxAB基因在菌株间的水平扩散。同样，目前还在 哈维弧菌和副溶血弧菌中发现有溶源性噬菌体，且 哈维弧菌对斑节对虾的致病性也与噬菌体相关。 另外，温和噬菌体还通过转导作用传递抗生素耐药 基因。因此，在应用噬菌体之前需对噬菌体的基 因组进行测序，以排除噬菌体携带毒素基因或抗生 素耐药基因的可能性；同时，也可通过噬菌体是否 携带阻遏蛋白和整合酶基因来初步判断其溶源性。目前可采用基因工程手段将温和噬菌体改造 为烈性噬菌体。Dedrick等为侵染脓肿分枝杆菌 (M. abscessus)的温和噬菌体，通过基因工程手段 将其阻遏蛋白基因gene45敲除后，使其丧失溶源能 力而变为烈性噬菌体；此株噬菌体最近被首次用来 治疗人分枝杆菌感染，可让患者症状明显缓解。噬菌体将体内感染病灶处革兰氏阴性细菌裂 解后，短时间内引起细胞外膜层内毒素的大量释 放，这对哺乳动物而言，存在产生内毒素血症的风 险。在水产养殖中，脂多糖常被用来提高鱼类的非 特异免疫力，但超过安全剂量时同样对水产养殖动 物具有较强毒性作用。Verner Jeffreys等给 大西洋鮭腹腔注射噬菌体悬液，其中内毒素含量达 10⁶〜10⁷EU/mL,并未发现对鱼产生不良影响，这 可能是由于不同菌种来源的内毒素性质不同，且不 同 水产动物对内 毒素的敏感性也存在差异。一些噬菌体突变株能感染杀死细菌，但未引起 细胞裂解。如T4噬菌体表达穿孔素的基因t发生 琥珀突变后(此突变株命名为LysD),穿孔素不能 正常表达，无法在细胞膜上形成跨膜孔，这样裂解 酶不能穿过细胞膜到达肽聚糖层发挥溶菌作用，也 就避免了内毒素的释放。噬菌体LysD能有效 治疗小鼠大肠杆菌性腹膜炎，并降低炎症因子肿瘤 坏死因子a和白细胞介素6的水平，这为一些水产 用噬菌体的基因工程改造提供了新思路。

3结论与展望

    为适应我国渔业转方式、调结构的发展要求, 并从根本上解决水产品的质量安全问题，2017年我 国农业部开始在部分地区实施“渔药减量行动”，着 力推进水生动物病害防控方式向绿色、生态和环保 的方向转变。在此背景下，噬菌体作为抗生素替代 品应用于水产养殖以显示出其独特优势和巨大潜 力。但若将噬菌体像抗生素一样规模化推广使用, 仍有诸多问题需要解决。如噬菌体在不同水产动 物体内的药代动力学特征亟需阐明，以科学确定噬 菌体的给药方式、给药剂量和给药时间；噬菌体是 否会介导毒力或抗生素耐药基因转移到非靶细菌 上。噬菌体若作为生物制品投入市场，需要通过国 家药监部门严格的监管批准，同时也要考虑消费者 对噬菌体处理产品的接受程度。